疏水層析（HIC）亦稱為疏水作用層析，是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的層析技術(shù)。

 

    從作用機(jī)制來看，它屬于吸附層析。非極性化合物例如苯、環(huán)己烷在水中的溶解度非常小，與水混合時會形成互不相溶的兩相，即非極性分子有離開水相進(jìn)入非極性相的趨勢，即所謂的疏水性(Hydrophobicity)。非極性溶質(zhì)與水溶劑的相互作用則稱為疏水效應(yīng)(Hydrophobiceffect)。

 

    疏水效應(yīng)疏水作用(hydrophobicinteraction):非極性分子進(jìn)入水中，有聚集在一起形成小疏水面積的趨勢，保持這些非極性分子聚集在一起的作用則稱為疏水作用。對于可溶蛋白，溶劑是水，疏水側(cè)鏈因此被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部。終的結(jié)構(gòu)是適合周圍溶液的熱動力學(xué)折衷的結(jié)果。就球形蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而言，其分子中的疏水性殘基數(shù)是從外向內(nèi)逐步增加的。雖然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白內(nèi)部，有些則暴露在外，在蛋白質(zhì)表面形成疏疏水和親水部件表面的溶菌酶。疏水部分是深紅色,淺紅色的更少的疏水性。親水部分顯示在深藍(lán)色的,更少的親水部分是淺藍(lán)色。水區(qū)域，這部分暴露在外疏水性基團(tuán)稱為疏水補(bǔ)丁。

 

二、疏水層析原理

 

   高度規(guī)則的水殼層包圍在配基和蛋白的疏水表面周圍。疏水物質(zhì)被迫融合以減少這種殼的總面積（熵大）。在純水中，任何疏水效應(yīng)都太弱而不能導(dǎo)致配基和蛋白之間或蛋白自身的相互作用。鹽能夠增強(qiáng)疏水作用。

 

   親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合作用原理

 

①靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁(hydrophobicpatch)；

②令蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性(可逆變性較理想)，暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基；

③高鹽作用。疏水層析的特性所致，即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水性殘基才能與疏水性固定相作用。

 

   一般在lmol／L(NH4)2SO4或2mol／LNaCl高濃度鹽溶液中，親水性較強(qiáng)的組分物質(zhì)，會發(fā)生局部可逆性變性，并能被迫與疏水的固定相結(jié)合在一起。然后通過降低流動相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的物質(zhì)，按其結(jié)合能力大小，依次進(jìn)行解吸附。

 

    也就是：疏水作用弱(即親水性強(qiáng))的物質(zhì)，用高濃度鹽溶液洗脫時，會先被洗下來。當(dāng)鹽溶液濃度降低時，疏水作用強(qiáng)的物質(zhì)才會隨后被洗下來。（相同鹽濃度下，疏水作用弱的物質(zhì)先被洗下來，疏水作用強(qiáng)的物質(zhì)隨后被洗下來）。

 

    對于疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)，則需要在流動相添加適量有機(jī)溶劑降低極性才能達(dá)到解吸附的目的。

 

三、疏水層析介質(zhì)

 

    疏水層析介質(zhì)由基質(zhì)和配體(疏水性基團(tuán))兩部分構(gòu)成。基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用廣泛的疏水介質(zhì)。HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。


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